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東北大学 多元物質科学研究所 国際放射光イノベーション・スマート研究センター 南 後 恵 理 子 （国研）理化学研究所 放射光科学研究センター 姜 正 敏 （公財）高輝度光科学研究センター Luo Fangjia 、登 野 健 介 シリアルフェムト秒結晶構造解析におけるテープ駆動型装置開発と 時分割実験への応用 Abstract シリアルフェムト秒結晶構造解析では、無数の微結晶を X 線自由電子レーザー照射域に送る方式が用いられ、 試料消費量や時分割実験の観点で試料導入法が課題であった。我々は液滴による試料導入とテープ搬送を組み 合わせた Compact Tape-Driven Sample Delivery System （ CoT ）を開発し、試料消費量を削減すると共に結晶を 含む液滴を安定に X 線照射域まで搬送することに成功した。また二液混合型時分割実験を行い、リゾチームへ の阻害剤結合過程を観察した。本手法は、光感受性タンパク質のみならず、酵素や受容体など幅広いタンパク 質の動的構造解析への応用が期待される。 1．はじめに X 線自由電子レーザー（ XFEL ）の登場は、タン パク質結晶構造解析を大きく変えたといっても過言 ではないだろう。従来は、基本的に単結晶を用いて 回転させながら回折像を取得していたが、 XFEL を 用いたシリアルフェムト秒結晶構造解析 （ SFX ） では、 複数の微結晶から回折像を取得して三次元構造を得 る。複数の微結晶を使用する理由は、高強度の X 線 レーザーパルスにより結晶が損傷するためで、測定 には常に損傷を受けていない “ 新鮮 ” な結晶試料を 供給する必要がある。 SFX 実験では、この試料導 入方法が実験の鍵を握っており、ユーザーが最も苦 労する部分でもある。 今回、我々は SFX のためのテープ駆動型の試料 導入装置を開発した [1] 。更に酵素に阻害剤を添加す ることで、活性部位に阻害剤が結合していく様子を 捉えることにも成功した。本稿では本装置について 紹介し、時分割実験への応用についても紹介する。 2．SFX 実験における試料導入法とその課題 最初の SFX 実験で使用された方法は、液体ジェッ ト法である [2] 。この方法は微結晶を緩衝液に高い濃 度で懸濁し（ 10 7 ～ 8 個 /mL ） 、 50 ‒ 100 μ ｍ程度の直径 のガラスキャピラリーから高流速で流す方式である。 試料や結晶化条件に依存するが、このような高濃度 の結晶懸濁液を調製するには、 1 mL 当たり 10 ～ 20 mg 程度のタンパク質を必要とする。数 μm に集光 され、高い繰り返し周波数で照射される XFEL に効 率良く結晶が当たるようにするために最も容易な方 法として用いられてきた。しかし、細いノズルから 連続して流すためには、 数 10 ～数 100 μL/min といっ た流速が必要である。測定時間は結晶が XFEL に当 たる率（ヒット率）に依存し、ヒット率が高すぎて も回折点が重なり指数付けが困難になるため、最 大でも 60% 、概ね 20 ～ 30 ％で測定される。結晶の 空間群にもよるが、構造解析には概ね 1 万枚の回折 像を必要とするため、 XFEL が 30 Hz の場合は 20 分 程度で 1 データセットを取得できる。測定試料量を 減らすためにシースガスによって溶液の流れを絞る ことでより流速を抑えることも行われているが、試 料消費量が数 100 mg ～数 g にも及ぶ。従来の X 線 結晶構造解析で用いられるタンパク質の量は概ね数 mg であることを思うと、タンパク質結晶をこのよ うなスケールで調製することはなく、実験実施が容 易ではない。また、連続的な試料導入方法では、パ ルス間の XFEL が照射されない時間でも（ SACLA SPring-8/SACLA/NanoTerasu 利用者情報／Vol.2 No.1 （2026 年 3月号） 1 最近の研究から では典型的に 33 ms ） 、試料は流れ続けるため、そ の間の試料は浪費されることになる。 次に登場した試料輸送方法は、膜タンパク質の結 晶化で用いられる脂質（モノオレイン） [3] やグリー スなどの高粘度媒体 [4] を用いた方法である。この場 合は、数 100 nL/min 程度の低流速でも試料を連続 的に流すことが可能であり、試料消費量を大幅に抑 えることができる。一方で、媒体を結晶に添加する ことで回折能に影響を与えることもあること、バッ クグラウンドノイズの高さ、光励起による時分割実 験では、媒体の光透過性の低さが励起効率を低下さ せるなどの課題があった。 そんな中で次に SACLA で開発されたのは、真船 らによる液滴インジェクターであった [5] 。緩衝液に 懸濁させた微結晶をピエゾ素子による pL 単位の液 滴として吐出し、 XFEL に同期させて「不連続」に 試料を導入することで試料消費量を激減させること に成功した。しかし、この方法にも弱点はあった。 例えば、高速で吐出される微小の液滴に集光した XFEL を照射するのは、結晶サイズのばらつきや結 晶が沈殿することによる溶液中の結晶密度などに左 右され、容易ではなかった。また、液滴は数 10 m/s で移動するため、ポンプ光による励起を行った場合 に遅延時間を長くとることは難しく、光励起から 数 μs 程度の反応経過しか追うことができなかった。 タンパク質内部で起こる構造変化は μs ～ ms のタイ ムスケールで顕著である場合も多く、遅延時間が限 られるのは大きな課題であった。 3．テープ駆動型装置の開発 2017 年、液滴による試料吐出の欠点を克服する 新しい方法が Fuller らにより報告された [6] 。これは 液滴をテープ上に吐出して XFEL 照射領域まで送る 方法で、一定速度で安定して試料を搬送することが できる。この時に採用された液滴吐出は、音響液滴 射出（ Acoustic Droplet Ejection, ADE ）で、試料に 非接触で微量の液滴を生み出す方式であった。今ま での結晶を含む溶液の吐出は、キャピラリーなど細 い流路を用いてきた。このような細いノズルから結 晶懸濁液を吐出する際、結晶が密集してノズル付近 で詰まる問題が起こりやすかったことから、ノズ ルを用いず非接触で液滴を吐出できる ADE は画期 的である。しかし、装置自体が大きく、非常に高 額であるという課題もある。また、彼らの方法で は XFEL が液滴中の結晶に照射される際、テープに 対して平行に照射される。これは高強度の XFEL が テープに当たるとテープを損傷するためで、ベルト コンベアとして繰り返しテープを使用するために このような照射方式が用いられた。しかしながら、 １）回折像の半分程度にテープからの高いバックグ ラウンドノイズが生じる、２）液滴がテープ上で 盛り上がっていないと、テープに当たることなく XFEL を照射できないため、テープの撥水処理が不 可欠であった。動くテープの上にある数 10 μm の高 さの液滴に XFEL を照射するのは容易ではない。ま た、従来の試料導入装置（インジェクター）に比べ て、ベルトコンベア装置は大型であり、気軽に使え るものとは言い難かった。 そ こ で 我 々 は 異 な る XFEL 照 射 方 式 と 液 滴 吐 出を取り入れた新たなテープ駆動型試料導入装 置（ Compact Tape-Driven Sample Delivery System, CoT ）を開発した（ 図 1 ） 。この装置では、 XFEL の 照射はテープに対して垂直に行われる。平行に照射 される場合に比べ、液滴の高さは不要であるため撥 水処理は必要としない。その一方で照射後テープ 図 1 Compact Tape-Driven Sample Delivery System （ CoT ）の模式図 2 SPring-8/SACLA/NanoTerasu Information ／Vol.2 No.1 MARCH 2026 FROM LATEST RESEARCH に XFEL による穴が開くため、テープは一回の使用 で回収されるというカセットテープ方式を採用して いる。テープは厚さ 12.5 μm 、幅 3 ～ 5 mm のポリイ ミド製フィルムを用いる。これは、テープにかかる 張力に耐えて安定に駆動しつつ、極力バックグラウ ンドノイズを低減させ、かつ、容易に入手し加工で きる最も薄い厚さ（開発当時）である。また、液滴 吐出はパイプジェットと呼ばれるインジェクターで、 ピエゾ方式である。液滴吐出のタイミングを XFEL パルスに同期させて、液滴を照射位置に搬送してい る。液滴の吐出量はノズル径や試料の粘性に依存し、 一液滴当たり 2 ～ 14 nL 程度である。 XFEL が 30 Hz 、 液滴が 5 nL の場合、一時間当たりの量は 540 μL と なり、液体ジェットに比べて試料消費量は 10 分の １以下となる。 時分割実験への応用としては、光励起によるポン ププローブ型実験も可能である。従来の連続型試料 導入では、試料が流れ落ちてしまうため可能な遅延 時間の範囲が数 10 fs ～数 10 ms 程度に限られていた。 しかし、 CoT を用いた場合、 図 1 のパイプジェット 位置と XFEL の照射位置の間にポンプ光レーザーを 照射することで、秒スケールの長い遅延時間で測定 することも可能である。これはテープ速度を落とす と共に、リフトプレートの位置を変えることによ り、液滴吐出位置と XFEL 照射位置の距離を変える ことによって達成される。また、例えば基質と結晶 など二種類の液滴を別々に吐出して重ね合わせるこ とにより、低分子化合物の結合による反応開始も可 能である。実際、我々はこの二液混合型実験を行い、 CoT の実証を行った。 4．二液混合による阻害剤結合過程の観察 二種類の異なる液滴を吐出するため、 図 2 のよう に二台の液滴インジェクターを設置した。二つの液 滴は重ね合わさり、低分子化合物は結晶内部へと拡 散する。今回、酵素であるニワトリ卵白由来のリゾ チームの微結晶（ 1 または 3 ～ 5 μm ）と、その阻害 剤である N ‒アセチルグルコサミンを用いて実験を 行った。 その結果、混合時間と結晶サイズに応じて、活性 部位に結合する阻害剤の占有率が変化することが観 察された（ 図 3 、阻害剤上の電子密度図の明瞭さが 占有率と連動する） 。上段の結晶サイズが大きい場 図 2 . CoT を用いた二液混合実験の模式図 図 3 リゾチームに結合する阻害剤の電子密度の変化 リゾチームの活性部位構造の主鎖（線）を主に表示 している。一部のアミノ酸残基の側鎖は棒モデル にて表示している。上段は 3 ～ 5 μm 結晶を用いた 実験結果、下段は 1 μm 結晶を用いた結果。右下 の数字はそれぞれ混合時間を意味する。 2 . 0 s : 緑 で描画されている図は、炭素原子（ C α ）を繋いだ 主鎖構造を意味する。赤は酸素原子、青は窒素原 子を意味し、赤で表示した球は水分子である。青 色のメッシュは差フーリエマップ（ F o （混合後） F o （混 合前） ）を表す（上二つは 5 σ、下二つは 6 σで描画） 。 ACT は酢酸イオン、 E 35 、 Q 57 、 N 59 はアミノ酸 残基（一文字表記）である。ピンク色で表示され た図はピンク色が炭素原子を意味し、酸素原子と 窒素原子はそれぞれ赤、青である。 NDG は阻害 剤を意味する。 SPring-8/SACLA/NanoTerasu 利用者情報／Vol.2 No.1 （2026 年 3月号） 3 最近の研究から 合は、混合から 2 秒後において、阻害剤の電子密度 は観察されなかったが、下段の小さな結晶の場合 は 1.3 秒後でも阻害剤の電子密度が観察された。ま た、混合から 9.7 秒後は大きな結晶でも阻害剤の結 合が観察されたが、結晶サイズが小さい方が高い占 有率であった。これは、結晶内部への阻害剤の拡散 が混合時間や結晶サイズに依存することを示してお り、 CoT の結晶溶液吐出タイミングやその搬送が正 確に行われていることを実証することができた。 5．おわりに 二液混合による時分割 SFX はマイクロ流路型デ バイスを用いた方法が報告されており [7,8] 、数 10 ミ リ秒といった早い混合時間での観察が可能である一 方、非常に試料消費量が多いことが課題となって いる。本法による二液混合実験は数 10 ～数 100 分 の 1 に試料消費量を抑えることができる。本装置を 用いた二液混合実験において可能な遅延時間は、前 述のマイクロ流路型デバイスに比べると若干劣るこ とは否めない。現状ではテープ速度を最大限の 300 mm/s にすると 130 ms 程度が計算値としては可能で ある。また、遅い方は、テープ搬送速度自体を遅く することは可能であるが、遅すぎると隣接の液滴同 士が重なるために、 15 mm/s のテープ速度が限界で、 概ね最長 19.3 s まで伸ばすことが可能と予想される。 遅延時間の幅や、拡散効率の向上など課題もある が、試料消費量の低減は大きな利点である。今まで 時分割実験の多くは光感受性試料に限られてきたが、 光感受性タンパク質はタンパク質全体の 1 ％にも満 たず、タンパク質動的構造解析の成功例は限定的で あった。今後は酵素反応や受容体へのリガンド結合 など様々なタンパク質の時分割実験への応用が可能 であり、タンパク質が機能を発揮する際の動きや内 部で起こる反応への理解や、それを踏まえた分子設 計などが期待される。 参考文献 [ 1 ] J. Kang, et al .: J. Appl. Cryst. in press [ 2 ] D. P. DePonte, et al .: J. Phys. D Appl. Phys . 41 (2008) 195505 [ 3 ] U. Weierstall, et al. : Nat. Commun . 5 (2014) 3309 [ 4 ] M. Sugahara et al .: Nat. Methods 12 (2015) 61 [ 5 ] F. Mafune et al .: Acta Cryst. D 72 (2016) 520-523 [ 6 ] F. D. Fuller, et al .: Nat. Methods 14 (2017) 443-449 [ 7 ] J.R. Stagno, et al .: Nature 541 (2017) 242-246 [ 8 ] Murakawa, T. et al .: Nat. Commun . 16 (2025) 11149 南後 恵理子 NANGO Eriko 東北大学 多元物質科学研究所／ 国際放射光イノベーション・スマート研究センター 〒 980 - 8577 宮城県仙台市青葉区片平２－１－１ TEL : 022 - 217 - 5345 e-mail : eriko.nango.c 4 @tohoku.ac.jp 姜 正敏 KANG Jungmin （国研）理化学研究所 放射光科学研究センター SACLA ビームライン基盤グループ 〒 679 - 5198 兵庫県佐用郡佐用町光都 1 丁目 1 - 1 TEL : 0791 - 58 - 0802 e-mail : j.kang@spring 8 .or.jp Luo Fangjia （公財）高輝度光科学研究センター 回折・散乱推進室 〒 679 - 5198 兵庫県佐用郡佐用町光都 1 丁目 1 - 1 TEL : 0791 - 58 - 0802 e-mail : luo.fangjia@spring 8 .or.jp 登野 健介 TONO Kensuke （公財）高輝度光科学研究センター 分光・イメージング推進室／ XFEL 利用研究推進室 〒 679 - 5198 兵庫県佐用郡佐用町光都 1 丁目 1 - 1 TEL : 0791 - 58 - 0833 e-mail : tono@spring 8 .or.jp 4 SPring-8/SACLA/NanoTerasu Information ／Vol.2 No.1 MARCH 2026 FROM LATEST RESEARCH